viernes, 13 de junio de 2014

Transferencia horizontal generalizada del ADN de los transgénicos

Pero casi nadie lo está teniendo en cuenta

La negativa a reconocer la transferencia horizontal de los ácidos nucleicos modificados genéticamente prevalece frente a las evidencias de que se está produciendo de forma generalizada si se utilizan los métodos adecuados para su detección, dice la Dra. Mae-Wan Ho.

Este artículo ha sido enviado a la Dra. Kaare Nielsen, que forma parte de la Comisión sobre transgénicos de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y se le concede el derecho a réplica.

En países como España (en color rojo) el porcentaje de bacterias resistentes a los antibióticos avanzados supera ya el veinticinco por ciento.

El primer cultivo modificado genéticamente fue aprobado y comercializado hace 20 años. Desde entonces hemos estado advirtiendo de forma repetida de los peligros de la transferencia horizontal no intencionada de ADN modificado genéticamente (transgénicos). Se hizo una revisión completa en [1] Gene Technology and Gene Ecology of Infectious Diseases, publicaciones científicas de ISIS) y sucesivas actualizaciones que fueron enviadas a laOrganización Mundial de la Salud (OMS), las Agencias de regulación de Estados Unidos, el Reino Unido y la Unión Europea (véase [2] Ban GMOs Now, ISIS Report). Pero todo ha sido en vano.

La posición adoptada por las Agencias de regulación y sus asesores científicos quizás tiene su máxima representación en una publicación reciente (3), que tiene como autora principal a Kaare Nielsen de la Universidad Noruega de Ciencia y Tecnología, que aconseja al Genøk-Centre for Biosafety, formando parte de la EFSA (Autoridad de Seguridad Alimentaria) en lo relativo a los transgénicos.

El documento, titulado “La detección de transferencia de genes es algo poco común en las poblaciones bacterianas”, reconoce que la transferencia horizontal de genes es uno de los riesgos de la Ingeniería Genética, y que el cultivo a gran escala de los transgénicos, más de 170 millones de hectáreas en todo el mundo, es una oportunidad de exposición de las bacterias al ADN recombinante y por lo tanto una oportunidad de difusión horizontal no intencionada de transgenes. “Se admite que la transferencia horizontal de genes ha sido demostrada en el laboratorio. Pero en los entornos naturales, las evidencias son negativas o no concluyentes según la mayor parte de los estudios que se han realizado en nuestros suelos agrícolas, en las aguas de escorrentía y en el contenido gastrointestinal”.

También se nos dice que la investigación de la transferencia horizontal de genes “adolece de importantes limitaciones metodológicas, incertidumbre en el modelo y lagunas de conocimiento”.En concreto, se dice que debido a la “baja probabilidad de que se produzca la transferencia horizontal de genes… en entornos complejos (llevaría) meses, años o incluso más tiempo para que las pocas células transformadas inicialmente se dividan y adquieran una relevancia numérica suficiente para que sean detectables”. El resto del documento hace mención a un modelo matemático basado en los mismos supuestos, es decir, la muy baja probabilidad de que se produzca la transferencia horizontal, que ha sido refutada empíricamente, siendo el más decisivo el estudio publicado en China en 2012 (4).

He revisado a fondo las evidencias a favor de la transferencia horizontal de ácidos nucleicos de los transgénicos (2). El presente artículo es una actualización de los nuevos descubrimientos.

Incluso el ADN de longitud corta y dañado se transfiere fácilmente, sin embargo se ignora el ADN transgénico

Nielsen es una de las investigadoras principales de un nuevo estudio (5), en el que se muestra que incluso el ADN de longitud corta y dañado, omnipresente en la mayoría de los entornos, es fácilmente absorbido por muchas bacterias y se incorpora al genoma bacteriano. Estos resultados no sólo contradicen la anterior afirmación de que la transferencia horizontal de ADN transgénico tiene una baja probabilidad, sino un trabajo anterior que decía que sólo secuencias mucho más largas se podían transferir de forma efectiva. El nuevo estudio demuestra que las secuencias dañadas y degradas, de tal sólo 20 pares de bares, pueden incorporarse al genoma bacteriano, incluyendo el ADN de un viejo hueso de mamut de 43.000 años de antigüedad. La importancia de la investigación ya queda reflejada en la página 1: “Nuestros hallazgos sugieren que el intercambio genético natural de ADN de organismos muertos e incluso de organismos extintos con las bacterias actuales puede producirse a lo largo de cientos de miles de años. De ahí que el papel del ADN dañado y degradado no se haya tenido en cuenta en la evolución bacteriana, con implicaciones en la teoría de la evolución”.

Pero no se hace ninguna mención de la enorme cantidad de ADN transgénico que se libera al medio ambiente por parte de los cultivos transgénicos, que sin duda se puede incorporar a los genomas bacterianos por mecanismos similares.

Nielsen y su colegas señalan que la transformación natural por la incorporación de fragmentos cortos de ADN son susceptibles de provocar una sustitución de bases, lo que da lugar a una modificación o pérdida de la función de los genes, en lugar de la adquisición e integración de genes completos, que ocurre con la transformación producida por fragmentos de ADN de mayor longitud. (Se olvidan que la secuencia de promotores/potenciadores de genes y secuencias que codifican una gran cantidad de ARN regulador, recientemente descubierto (6), pueden ser de muy escasa longitud, y cuando se incorporan a los genomas bacterianos pueden tener unos importantes efectos en la expresión génica y las funciones biológicas, lo cual puede provocar enfermedades en las plantas, en los animales y seres humanos).

Más importante aún, las moléculas cortas de ADN no se encuentran con las mismas barreras en la transformación natural que los fragmentos más largos de ADN, como conflictos en el orden de los genes, la funcionalidad y similitud del ADN. Aunque los requisitos de similitud del ADN están todavía presentes, los fragmentos cortos de ADN similares es más probable que se encuentren en una gama más amplia de especies, y la similitud de secuencia aumenta las probabilidades a medida que el tamaño del fragmento disminuye.

Las frecuencias de transformación de secuencias cortas de ADN son relativamente menores en comparación con las secuencias largas, pero, como señalan los autores, las secuencias cortas de ADN son mucho más abundantes en el entorno que las secuencias largas, debido a que la mayoría de las secuencias de ADN están en varios estados de degradación.

Nielsen y sus colegas destacan el hecho de que dos cambios en nucleótidos adyacentes (que son más propensos a los cambios que los nucleótidos individuales) pueden provocar un aumento considerable de resistencia a los antibióticos y “las prácticas de eliminación de residuos y descontaminación biológica, por ejemplo en los hospitales donde son comunes las infecciones resistentes a los antibióticos, se centran en el control de los organismos en lugar de las moléculas de ADN libres, y generalmente provoca una fragmentación sólo parcial del ADN”.En este contexto, los autores podrían habrían incluido también a los laboratorios e instalaciones en los que se desarrollan los microorganismos modificados genéticamente, de los cuales grandes cantidades de ácidos nucleicos se esparcen por el medio ambiente, considerándose una liberación tolerada (7) (SLIPPING THROUGH THE REGULATORY NET: ‘Naked’ and ‘free’ nucleic acids, ISIS/TWN report).

Los autores hacen referencia de forma constante a la transformación natural para enfatizar la idea cada vez más aceptada de que la transferencia horizontal de genes forma parte de las increíbles hazañas de la ingeniería genética natural o modificación genética natural, que los organismos y las células llevan a cabo para sobrevivir (véase [8] Evolution by Natural Genetic Engineering, SiS 63). Sin embargo, no hay nada natural en los ácidos nucleicos de los transgénicos, que contienen numerosas piezas sintéticas y nuevas combinaciones, diseñadas para superar y anular los procesos de modificación genética natural. Los ácidos nucleicos modificados genéticamente pueden explotar los procesos de transformación natural, causando estragos en la salud y el medio ambiente (2,9). Ya hay evidencias de que las secuencias cortas de ADN degradado pueden ser fácilmente absorbidas por las células humanas, integrándose en el genoma; que los ácidos nucleicos son secretados activamente por las células del sistema circulatorio, y los ácidos nucleicos presentes en los alimentos pueden entrar en el torrente sanguíneo e influir en la expresión génica de las células corporales (véase [10] Nucleic Acid Invaders from Food Confirmed, SiS 63).

Nielsen et al. (3,5), aunque no niegan que se puede producir la transferencia horizontal de ácidos nucleicos modificados genéticamente, dan la impresión equivocada de que tienen una probabilidad muy baja, confundiendo a la gente con una falsa sensación de seguridad, dando así licencia para una continua emisión de transgénicos al medio ambiente. Lamentablemente, los argumentos se han estado basando en unos supuestos ya obsoletos en relación con la capacidad de transformación de las bacterias y la probabilidad de transferencia horizontal de genes, así como las tecnologías obsoletas para la detección de la transferencia horizontal de genes, que tenían muy poca sensibilidad (3). Han ignorado los nuevos hallazgos, incluido el suyo propio, y el hecho de que las tecnologías han avanzado a pasos agigantados en los últimos años. Ahora es posible detectar la transferencia horizontal de genes directamente sin realizar un cultivo de bacterias (véase [2]). Esto es muy importante, ya que la mayor parte de las bacterias presentes en el medio ambiente no se pueden cultivar en el laboratorio, y en consecuencia la detección directa está revelando más altas frecuencias de transferencia horizontal de genes. Además, las PCR (reacciones en cadena de la polimerasa) para la detección de secuencias específicas y los métodos de secuenciación de ácidos nucleicos han mejorado hasta el punto de que incluso se puede hacer en células individuales (11). Finalmente, para detectar el ADN de los transgénicos es necesario el uso de sondas moleculares apropiadas (cebadores) y análisis basados en bases de datos bioinformáticas pertinentes. Con el uso de estos métodos, los científicos chinos han detectado el gen específico que marcaba la resistencia a los antibióticos en los plásmidos comerciales, cada vez más presentes en los ríos de China [4] (ver más abajo), a pesar de que el país no ha importado grandes cantidades de transgénicos.

Las especies no transformables son fácilmente transformables

La suposición de que sólo algunas bacterias se transformables de forma natural es algo que se pone en duda, otra indicación de que la transferencia horizontal de genes por la absorción de los ácidos nucleicos está mucho más extendida de lo que se ha dicho. Los investigadores dirigidos por Dongchang Sun de la Academia de Ciencias Agrícolas Hongzhou China, de Zhejian, han descubierto que las especies no transformables de bacterias utilizadas de forma corriente en el laboratorio, como Escherichia coli, son fácilmente transformables por plásmidos (pequeñas estructuras genéticas de forma por lo general circular, y muy utilizados en la manipulación genética) (12). La transferencia de genes a través de los plásmidos es una de las principales rutas de propagación de la resistencia a los antibióticos de las bacterias. Los brotes de superbacterias que amenazan la vida, tales como la NSM-1 y la Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) son a menudo debidos a la transferencia de genes de resistencia a los antibióticos por los plásmidos. Aunque la transferencia de plásmidos por conjugación (un proceso de apareamiento bacteriano) fue descubierto en la E. coli hace mucho tiempo, la especie ha sido considerado tradicionalmente como no transformable y con la necesidad de tratamientos especiales, tales como descargas eléctricas o estimulación mediante Ca2+ y choque térmico, sin embargo, se encuentra en el genoma de la E. coli un juego completo de genes homólogos con capacidad para la absorción de ADN. Por otra parte, la transcripción de algunos genes se puede inducir por un regulador homólogo Sxy. El equipo mostró previamente que Escherichia coli puede adquirir ADN desnudo del plásmido en las placas de agar a 37º C, sin ningún tratamiento especial. La transformación espontánea del plásmido de Escherichia coli es independiente de la maquinaria de absorción del ADN de una sola hebra. El ADN es rápidamente absorbido, en un plazo de dos minutos de exposición, y la mayor parte del ADN se habrá incorporado a las células de Escherichia coli en un plazo de 10 minutos.

El gen de resistencia a los antibióticos de los plásmidos sintéticos se encuentran en todos los ríos de China

A finales de 2012, Li Jun Wen, Jin Min y sus colegas de la Universidad de Sichuan en China informaron del hallazgo de plásmidos procedentes de la Ingeniería Genética, que contienen un gen de resistencia a los antibióticos en 6 ríos de China (4). Hemos informado de forma amplia sobre esto [13] GM Antibiotic Resistance in China’s Rivers (SiS 57), incluyendo una lista de los cultivos transgénicos ya comercializados, en fase de ensayo, o importados, que contienen el gen bla resistente a la ampicilina

Es muy importante el trabajo de estos investigadores que se propusieron investigar específicamente si el gen de resistencia a los antibióticos debido al empleo de la Ingeniería Genética estaba presente en el medio ambiente, usando sondas moleculares adecuadas y otras herramientas disponibles. Es la primera vez que se realiza un estudio de este tipo en todo el mundo. En consecuencia, las declaraciones como las realizadas por Nielsen et al. [3] y otras Agencias de regulación y defensores de los transgénicos, que la transferencia horizontal de transgenes no se produce, o sólo lo hace muy rara vez en la naturaleza, están en contradicción con lo dicho anteriormente. Simplemente no lo han buscado: “ no mires y no lo encontrarás”.

El equipo de investigación de la Universidad de Sichuan escribió [4] (páginas 13.348-9): “Si bien los vectores plasmídicos resistentes a los antibióticos han demostrado ser herramientas muy valiosas para la Ingeniería Genética, estas secuencias de ADN recombinante con un expresión muy alta de resistencia los antibióticos presenta un riesgo desconocido por su presencia más allá de los laboratorios”.

El uso de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y la PCR cuantitativa en tiempo real, con una combinación de cebadores diseñados para detectar los plásmidos sintéticos que contienen el gen de resistencia a los antibióticos, detectaron varios niveles del gen bla en los 6 ríos analizados, con los niveles más altos en los ríos Haihe y Pearl. (Figura 1. Nota: Para acceder a la información adicional es necesario estar registrado en el sitio web de ISIS)

Los plásmidos encontrados en las muestras de agua de los ríos se utilizaron para transformar las células de E. coli y crear una biblioteca metagenómica de plásmidos, con 205 cepas resistentes a la ampicilina. De éstass, el 27,3% dieron positivo al gen bla utilizando el análisis PCR. La secuenciación confirmó la presencia del vector plásmido sintético. Además, las pruebas de resistencia a los antibióticos confirmaron la resistencia a la ampicilina de los plásmidos del ambiente. El espectro de resistencia encontrado en los ríos Pearl y Haihe, en particular, se había expandido hasta la tercera y cuarta generaciones de medicamentos de cefalosporinas, estando también implicadas las cefalosporinas de primera y segunda generación.

Los investigadores explicaron por qué se fijaron en la resistencia a los plásmidos sintéticos resistentes a los antibióticos (páginas 13448-9): “Los plásmidos han sido utilizados como herramientas experimentales para facilitar el desarrollo de una Ingeniería Genética rápida y eficiente. Para mejorar la eficiencia de la transformación, los vectores plásmidos sintéticos, se desarrollaron con una serie de marcadores genéticos seleccionables, entre los cuales se encuentran las secuencias de resistencia a los antibióticos, que resultaron especialmente útiles. Además, la manipulación para lograr la transferencia permitió que estos plásmidos sintéticos llevasen varios genes de resistencia a fármacos, que se transfieren horizontalmente como mucha facilidad en el laboratorio.

Durante la última década la tecnología de la Ingeniería Genética se ha expandido más allá de la investigación científica y se ha introducido en la Industria, incluyendo la fermentación para la producción de biocombustibles, la agricultura y limpia del medio ambiente. En consecuencia, los vectores plásmidos sintéticos utilizados en las aplicaciones industriales tienen una mayor probabilidad de liberarse al medio de forma incontrolada, lo que supone un riesgo de transmisión de los genes de resistencia a los antibióticos a los microbios naturales”.

El gen recombinante bla deriva del gen silvestre hidrolasa beta-lactámico, que confiere resistencia a los agentes patógenos frente a los medicamentos e incluyen el amplio espectro de las beta-lactamasas y metalo beta-lactamasas Nueva Delhi (NDM-1), pero que también tienen altas tasas de mutaciones.

Tres pares de cebadores universales fueron diseñados para detectar el gen bla y dos pares de cebadores para los vectores sintéticos pUC y pBR322, respectivamente, que permiten la detección de la secuencia de ADN extraño introducido en el gen bla recombinante.

Los productos de PCR obtenidos de las 6 muestras recogidas en los ríos y los 6 transformantes de la biblioteca metagenómica de plásmidos, fueron seleccionados para la alineación de secuencias y análisis filogenético. Las alineaciones sirven para determinar las construcciones artificiales o sintéticas, incluyendo la expresión, el transporte, la fusión de genes y los vectores de clonación mediante genes trampa. Además, los resultados de los análisis para los vectores (VecScreen) demostraron que los segmentos coinciden en gran medida con el vector pBR322, con una identidad en la secuencia de hasta el 100%. Además, el análisis sistemático de las regiones emparejadas reveló la presencia parcial del gen bla en todas las muestras y los transformantes.

El equipo explicó su metodología con más detalle en la discusión (página 13542): “El gen bla fue desarrollado por tecnología recombinante como un fragmento funcional ( aproximadamente 861 pares de bases) para soportar la clonación. A lo largo de los años, esta secuencia selectiva de antibióticos se ha introducido en una serie de vectores de clonación, incluyendo pBR322 y pRC19c, que se han convertido en herramientas clave de la Ingeniería Genética en el laboratorio y más allá, como la agricultura”.

Aunque la secuencia del gen bla del vector plasmídico sintético (locus 3293-4153) es idéntica a la del plásmido silvestre, una diferencia sustancial en el gen bla era evidente: la secuencia aparecía en sentido inverso. Específicamente, el gen de la transposasa presente en el tipo silvestre Tn3 desapareció y el locus pBR322 11763 a 3146 se obtuvo de otro plásmido, el pMB1. Estas características distintivas de la secuencia permiten distinguir los vectores presentes en el gen bla del plásmido sintético obtenido a partir del gen bla del plásmido silvestre, utilizando métodos de secuenciación, como PCR con cebadores diseñados para abarcar los loci 1773-3146 y 3293-4153. Por otra parte, el locus pBR322 2347-4353 se encontró que era compartido con pUC19. Por lo tanto, en su estudio, se utilizaron PCR y cebadores qPCR específicos, con vectores plásmidos sintéticos destinados a las regiones 3086-3448 y 3243-3305 para estudiar la existencia y distribución de los genes resistentes a la ampicilina y comprobar la contaminación de los microbios presentes en el ambiente. Y para su sorpresa, se detectó el gen bla del plásmido sintético en las muestras tomadas de los seis ríos.

Las muestras recogidas en el ambiente se han obtenido de una comunidad bacteriana compleja y dinámica y con especies que no se pueden cultivar. Incluso aquellas que pueden ser cultivadas no todos los plásmidos se pueden extraer. La tecnología metagenómica consiste en la transformación del ADN genómico del medio ambiente en una cepa de laboratorio, que es la única forma de estudiar muestras genéticas complejas a partir de los ecosistemas sin purificar las cepas. Recientemente se ha demostrado que es útil en el análisis de diversas muestras recogidas del ambiente. Este es el método utilizado en el estudio. Los plásmidos se extrajeron directamente de los microorganismos del medio ambiente para la transformación en laboratorio de E. coli y se construyó una biblioteca metagenómica de plásmidos, con 205 cepas de resistencia a la ampicilina, de los cuales el 27,3% dieron positivo en la presencia del gen bla.

Llegaron a la siguiente conclusión (página 13454): “Debido a los peligros potenciales de la liberación al ambiente de vectores plásmidos sintéticos y productos modificados genéticamente que contienen los componen del vector, se debe prestar mayor atención”.

La Organización Mundial de la Salud ha publicado recientemente en este 2014 un Informe sobre la resistencia a los antimicrobianos, haciendo sonar la alarma sobre la creciente ineficacia de los antimicrobianos, exhortando a la naciones del mundo que eviten el uso excesivo y el abuso de antibióticos (4). Sin embargo, no se menciona que los transgénicos y las tecnologías de modificación genética en su conjunto, como ha demostrado el estudio realizado en China, es una importante fuente de resistencia a los antibióticos, afectando a los seres humanos y al ganado. La importancia de la modificación genética en la propagación de la resistencia a los antibióticos ya fue predicha en el artículo publicado en 1998 (1).

Genetistas moleculares de Europa, Estados Unidos y otros países deben investigar ahora la presencia de ácidos nucleicos modificados genéticamente, incluidos los genes marcadores de resistencia a los antibióticos presentes en el medio ambiente. Pero mientras se debiera detener el vertido de ácidos nucleicos modificados genéticamente, ya sea de forma deliberada, tolerada o a partir de un uso confinado.

Por la Dra. Mae-Wan Ho, 9 de junio de 2014


por NOTICIASDEABAJO • 12 JUNIO, 2014

https://noticiasdeabajo.wordpress.com/2014/06/12/transferencia-horizontal-generalizada-del-adn-de-los-transgenicos/

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